消毒（dú）劑對枯草杆菌黑色變種芽孢殺滅效果檢（jiǎn）測技術規範：從（cóng）芽孢製備到滅菌驗證

消毒劑對枯草（cǎo）杆菌黑色變種芽（yá）孢殺滅（miè）效果檢（jiǎn）測技術規（guī）範：從芽孢製備到滅菌驗（yàn）證

一（yī）、檢測原理與標準依據

1. 芽孢特性與檢測意義

枯草杆菌（jun1）黑色變種芽孢（Bacillus subtilis var. niger，ATCC 9372）具有以下（xià）特性：

結構優勢：芽（yá）孢（bāo）壁厚且含吡啶二羧酸鈣，對化學消毒劑抵抗力（lì）比繁殖體高10³-10⁵倍

指示作用：用於評價滅（miè）菌劑（如甲醛、過氧（yǎng）乙（yǐ）酸）和高水平消毒劑的殺菌效力，是滅（miè）菌效果驗證的金標準

2. 核（hé）心標準要求

GB 15981-2012《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》：

滅菌劑對芽孢殺滅對數值（zhí）（KL）≥5.0

高水平消毒劑（jì）KL≥3.0

ISO 11138-1:2017《滅菌過程的確認和常規控製 第1部分：醫療保健產品滅菌的通用要求（qiú）》

二、芽孢製備與（yǔ）純化技術

1. 菌株培養與芽孢形成

（1）培養（yǎng）基與培養條（tiáo）件

營養（yǎng）瓊脂配方：蛋白腖10g、牛（niú）肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂（zhī）15g，pH 7.2±0.1

培養程序：37℃培養72小時，鏡檢芽（yá）孢（bāo）形成率≥90%

（2）芽孢純化步驟

1.刮取瓊脂表麵（miàn）菌苔，加入10mL 0.03mol/L PBS，振蕩（dàng）10分鍾

2.3000rpm離心10分鍾，棄上清，重複洗滌3次

3.80℃水浴加熱10分鍾，殺滅殘留繁殖體

4.調整濃度至10⁸CFU/mL（血球計數板計數）

2. 芽孢活力驗證

耐熱性測試：121℃高壓滅菌2分鍾，存活芽孢數應≥10⁶CFU/mL

純度檢查：革蘭染色鏡檢，芽孢形態應均一（yī），無雜菌汙染

三、殺滅效果（guǒ）檢測方法

1. 載體定量滅菌試驗（仲裁方法）

（1）載體選擇與製備（bèi）

材質：不鏽鋼片（1cm×1cm）或玻璃（lí）片，經160℃幹熱滅菌2小時

染菌（jun1）步驟：取10μL芽（yá）孢懸液（10⁸CFU/mL）滴加於載體，37℃幹燥60分鍾（形成芽孢膜）

（2）消毒處理與中和（hé）

1.暴（bào）露條（tiáo）件：載體wan全浸（jìn）泡於消毒（dú）劑中，設定作用時間梯度（15min、30min、60min）

2.中和程序：取出（chū）載體放入含5mL中和劑的（de）試管（如0.1%硫代liu酸鈉+0.5%吐溫80），超聲洗脫1分鍾

3.活菌計數：取洗脫液0.1mL塗布營養瓊脂平板，37℃培養48-72小時，計數菌落

（3）對照組設置

陽（yáng）性（xìng）對照：載體染菌後不消毒，直接中和培養

陰性對照：消毒劑+中和（hé）劑（jì）（無菌操作）

中和劑（jì）對照：中和劑+芽孢懸液（驗證中和有效性）

2. 懸液定量殺滅試（shì）驗（快速篩選）

取0.5mL芽孢懸液+4.5mL消毒劑，20℃水浴作用指定時間後取樣中和，傾（qīng）注平板培養

四、結果計算與判定

1. 殺滅對數值（KL）計算

式中：

——陽（yáng）性對照組平均芽孢數（CFU/載體（tǐ））

——試驗組平均活菌數（CFU/載體（tǐ））

2. 結果判（pàn）定（dìng）標準

消毒劑類型要求KL值應用場（chǎng）景

滅菌劑≥5.0手術器械、植入物

高水平消毒劑≥3.0內鏡、呼吸機管路（lù）

中水平消毒劑≥2.0物體（tǐ）表麵、環境消毒

3. 典型數據示例

對照組：N₀=8.6×10⁶CFU/載（zǎi）體

試（shì）驗組：作（zuò）用30min後Nt=52CFU/載體

計算：KL=lg(8.6×10⁶/52)=5.22（符合滅菌要求）

五、影響因素與優化策略

1. 關鍵影響因素

因素影響機製控製措施

有機物幹擾蛋白質包裹芽孢，阻礙消毒劑滲透加入5%小牛血清模擬汙染，提高消毒劑濃度

溫度低溫降低化學反應速率低於20℃時延長作用時間50%

pH值過酸/過堿影響消毒劑穩定性調整消（xiāo）毒劑pH至說明書推（tuī）薦範圍

2. 挑戰性試驗條件

低溫滅菌：10℃條件下評價低溫滅（miè）菌劑效果（guǒ）

生物膜模型：芽孢（bāo）與大腸杆菌共培養形成生物膜，模擬（nǐ）複雜汙染場景（jǐng）

六、案例（lì）分析與應用

案例1：過（guò）氧乙酸滅菌效果驗證

試驗條件：0.5%過氧乙酸，30℃作用30分鍾，載（zǎi）體法

結果：N₀=5.2×10⁶CFU/載體，Nt=38CFU/載體，KL=5.14（符合滅（miè）菌要求）

案例2：低溫條件下殺滅效果下降

溫度作用時（shí）間KL值結論

25℃30min5.8合格

10℃30min3.2需延長至60min

七、質量控製與注意事項（xiàng）

1. 試驗全程質控

芽（yá）孢批次一致性：每批次芽孢需（xū）進行（háng）活力和耐熱性驗證

平行樣重複性：每個濃度做3次平行試（shì）驗，KL值相對偏差≤15%

培養時間：芽孢萌發較慢，培養時間需≥48小時

2. 安全（quán）操作規範（fàn）

芽孢懸液需在生物（wù）安全櫃內操作，避免氣溶膠汙染

廢棄樣品需經121℃高壓滅菌30分鍾後處理（lǐ）

注：本規範適用於滅菌劑和高水平消毒（dú）劑驗證，檢測周期5-7天，報告需包（bāo）含芽孢製備、消毒參數、KL值及判定結論。